Rome Transplant Network



La Rome Transplant Network (RTN) è una rete metropolitana di centri di eccellenza per il trapianto di cellule staminali finalizzato alla cura di malattie ematologiche. RTN è un modello innovativo nella cooperazione multicentrica e unico in ambito europeo.

La RTN ha acquisito i criteri e le procedure di accreditamento e qualificazione internazionali per i Centri di trapianto certificate dall’organismo di controllo JACIE (Joint Accreditation Committee ISHAGE-EBMT).

Recependo le direttive della comunità scientifica internazionale e in accordo con quanto stabilito nel documento “Linee Guida per la Raccolta, Manipolazione ed Applicazione Clinica delle Cellule Staminali Ematopoietiche " del GITMO (Gruppo Italiano per il Trapianto di Midollo Osseo), la RTN regola la propria attività di trapianto CSE all’interno di un più generale Programma Unico di Trapianto che include tre principali componenti:
  • Unità clinica di Trapianto
  • Unità di raccolta e processazione cellulare
  • Unità di manipolazione cellulare
Raccolta
La Raccolta delle Cellule Staminali Emopoietiche (CSE) consiste nel prelievo di un adeguato numero di progenitori emopoietici da una delle tre possibili fonti: il midollo osseo, il sangue periferico dopo mobilizzazione farmacologica, il sangue di cordone ombelicale.

APPROFONDISCI
Manipolazione
La Manipolazione cellulare è l’insieme delle procedure, più o meno complesse, che permettono alle cellule staminali emopoietiche di essere utilizzate ai fini trapiantologici.
 
APPROFONDISCI
Trapianto
La Manipolazione cellulare è l’insieme delle procedure, più o meno complesse, che permettono alle cellule staminali emopoietiche di essere utilizzate ai fini trapiantologici.
 
APPROFONDISCI


Un modello per la ricerca scientifica e per l'amministrazione pubblica.

Propositi e Finalità della RTN
 
  • Condividere da parte dei Centri Trapianto costituenti RTN, tutti i processi, le procedure ed i protocolli clinici e di ricerca relativi all’attività trapiantologica.
  • Conseguire ed estendere progressivamente a tutti i Centri un Sistema della Qualità per la gestione di processi, procedure e protocolli secondo i criteri internazionali stabiliti dal JACIE (Joint Accreditation Committee ISHAGE-EBMT) e da questi certificati.
  • Uniformare e mantenere, per il personale medico-infermieristico impiegato nei diversi Centri aderenti ad RTN, un costante e coordinato programma annuale di educazione e di formazione sanitaria, strutturato secondo i criteri ministeriali dell’ECM, inerente il campo specifico del trapianto di HPC.
  • Stabilire, nell’ambito di RTN, un unico data base dei pazienti trapiantati, che possa costituire casistica sufficientemente ampia ed uniforme, per criteri di selezione e trattamento, alla quale poter fare riferimento per ogni eventuale progetto di studio clinico.
  • Realizzare, nel complesso campo del trapianto di HPC, un originale e virtuoso sistema di collaborazione multicentrica cittadina che possa anche valere per altri settori clinici quale modello di cooperazione sanitaria ad estensione metropolitana.
Il Programma Trapianti di RTN persegue i seguenti obiettivi:
 
  • L’esecuzione di trapianti autologhi ed allogenici di HPC da qualunque fonte, sia in soggetti adulti che pediatrici, sia per malattie ematologiche che per affezioni non ematologiche;
  • L’identificazione del donatore alternativo per tutti i pazienti con indicazione al trapianto allogenico e che non dispongono di un donatore familiare compatibile;
  • La ricerca clinica e biologica nel campo delle cellule staminali e del loro impiego e la diffusione del prodotto della ricerca;
  • La formazione di operatori sanitari e di volontari dedicati allo specifico ambito del trapianto di HPC;
  • Garantire al paziente che usufruisce della struttura, la qualità delle cure erogate nel rispetto delle norme di sicurezza
  • Gestire in maniera efficiente ed efficace le risorse che ha a disposizione, monitorando l'impatto economico dei servizi erogati
        CERTIFICAZIONI:
Organismo internazionale che certifica i criteri e le procedure di accreditamento e qualificazione dei centri trapianto
Sistema di gestione della qualità

 

  

 

 

 



Programma trapianto di cellule staminali ematopoietiche
 
In linea con quanto stabilito di comune accordo tra i Centri di trapianto USA e quelli europei, le grandi società scientifiche internazionali ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering) ed EBMT (European Group for Blood & Marrow Transplantation) hanno acquisito i criteri e le procedure di accerditamento e qualificazione per i Centri trapianto elaborati dal FACT (Foundation for Accreditation of Cellular Therapy) .

Un organismo apposito, denominato JACIE (Joint Accreditation Committee ISHAGE-EBMT) alla cui formazione l’Italia ha consistentemente contribuito, è stato costituito in ambito europeo per educare i centri a conformarsi alle regole FACT ed indurre i rispettivi Paesi ad emanare normative in tal senso.

Il GITMO, (Gruppo Italiano per il Trapianto di Midollo Osseo) in accordo con il Centro Nazionale Trapianti e le principali Socoetà Scientifiche Nazionali (SIE, SIMTI, SIDE) coinvolte nella problematica del trapianto di cellule staminali emopoietiche e recependo le direttive della comunità scientifica internazionale, ha partecipato all’elaborazione del documento approvato nell’accordo Stato-Regioni e pubblicato sulla Gazzetta Ufficiale del 30 Settembre 2003 con il titolo “Linee Guida per la Raccolta, Manipolazione ed Applicazione Clinica delle Cellule Staminali Ematopoietiche ".

In conseguenza di tale accordo, la Regione Lazio, come pure le altre Regioni italiane, ha inviato alle Aziende Ospedaliere ed ai Policlinici Universitari la direttiva regionale del 09.06.2004, prot n..5057, in tema di impiego di cellule staminali emopoietiche , DGR n.245 del 02.04.2004.

In accordo con quanto stabilito nelle Linee guida, l’attività trapianto CSE è regolata all’interno di un più generale Programma Unico di Trapianto che include tre principali componenti:
  • Unità clinica
  • Unità di raccolta e processazione cellulare
  • Unità di manipolazione cellulare
Il programma trapianto è coordinato da un unico Direttore, responsabile dei protocolli operativi e della loro validazione, della certificazione di qualità delle procedure e relativi controlli, dei programmi infine di formazione continua del personale addetto. Il Programma Unico di Trapianto, corrispondendo a quelle che sono le applicazioni previste nei programmi di accreditamento e qualificazioni internazionali (FACT-JACIE), ai quali il documento delle Linee Guida fa espresso riferimento, può essere esteso a più centri appartenenti alla stessa area metropolitana.
        CERTIFICAZIONI:
Organismo internazionale che certifica i criteri e le procedure di accreditamento e qualificazione dei centri trapianto
Sistema di gestione della qualità

 

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La Raccolta delle cellule staminali emopoietiche

Il trapianto di cellule staminali emopoietiche consiste nel prelievo di un adeguato numero di progenitori emopoietici e nella loro successiva reinfusione per via endovenosa in un paziente , nel quale sia stata indotta un’aplasia midollare irreversibile mediante un regime terapeutico altamente aggressivo, definito “terapia di condizionamento”.
Al momento si riconoscono tre possibili fonti di cellule staminali emopoietiche: il midollo osseo, il sangue periferico dopo mobilizzazione farmacologica, il sangue di cordone ombelicale. Nei programmi terapeutici di trapianto di cellule staminali emopoietiche l’impiego di una delle tre fonti può dipendere generalmente dall’età del ricevente e del donatore, dal tipo di patologia, dallo stato clinico del paziente e, in alcuni casi, dalla scelta del donatore.
Cellule staminali emopoietiche da midollo osseo (espianto di midollo osseo)
Le cellule staminali emopoietiche possono essere prelevate direttamente dal midollo osseo. L’espianto di midollo osseo è una procedura, eseguita in anestesia generale o anche spinale, che consiste nel prelevare, dalle ossa del bacino, sangue midollare, ricco in cellule staminali, in quantità sufficiente da rigenerare la normale emopoiesi. Le cellule vengono aspirate mediante punture multiple delle cresta iliache posteriori con siringhe fornite di appositi aghi. Il prelievo generalmente dura poco più di un’ora e la quantità di sangue midollare prelevata varia da 10 a 20 ml/kg di peso del donatore, tenendo anche conto della taglia del ricevente.
Rischi della procedura
I rischi sono minimi, principalmente di tipo anestesiologico e paragonabili a quelli di un intervento chirurgico di lieve invasività.
Inoltre, in caso di prelievo midollare dal paziente per autotrapianto, considerato che negli adulti è necessario il prelievo di volumi pari a circa 800-1.000 ml, è possibile che lo stesso paziente debba essere sottoposto a trasfusione di eritrociti. In tal caso, vanno considerati anche i rischi legati alla trasfusione di emocomponenti.
Nel caso dei donatori sani per trapianto allogenico viene evitato il ricorso alla trasfusione di emocomponenti omologhi e viene invece impiegata la manovra di autotrasfusione con l’attuazione di programmi di autodeposito da eseguire prima dell’espianto.
Cellule staminali emopoietiche da sangue periferico
Il trapianto di cellule staminali emopoietiche da sangue periferico è ormai una procedura ben consolidata ed ampiamente utilizzata in molte patologie.
L’avvento in campo clinico dei fattori di crescita emopoietici, il miglioramento delle tecniche di identificazione, di raccolta e di manipolazione delle cellule staminali emopoietiche da sangue periferico hanno dato un notevole impulso alle strategie terapeutiche onco-ematologiche che prevedono il trapianto (sia autologo che allogenico) di cellule staminali emopoietiche derivanti da questa fonte.
Le cellule staminali emopoietiche possono essere raccolte direttamente dal sangue periferico mediante aferesi con l’impiego dei separatori cellulari. Il programma di raccolta delle cellule staminali emopoietiche da sangue periferico si articola in tre momenti distinti:
  • mobilizzazione delle cellule staminali emopoietiche dal comparto midollare verso il sangue periferico;
  • timingdella raccolta;
  • procedura di aferesi;
Mobilizzazione delle cellule staminali
Per mobilizzazione delle cellule staminali emopoietiche si intende un trattamento terapeutico che determina un incremento dei progenitori emopoietici circolanti, finalizzato alla loro raccolta mediante aferesi. Il razionale della mobilizzazione delle cellule staminali emopoietiche nel sangue periferico è di ridurre al minimo il numero di procedure necessarie per la raccolta di un’adeguata quantità di cellule staminali emopoietiche che possa garantire l’efficacia della procedura trapiantologica.
La mobilizzazione delle cellule staminali emopoietiche è un fenomeno ancora solo parzialmente conosciuto, legato da un lato all’alterazione dell’aderenza delle cellule staminali allo stroma midollare e dall’altro all’attivazione ed all’aumento della permeabilità dell’endotelio dei sinusoidi midollari.
Il G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) è un fattore di crescita emopoietico che stimola il midollo a produrre un maggior numero di cellule della serie bianca. Generalmente viene impiegato durante le fasi di ricostituzione emopoietica dopo chemioterapia mieloablativa. Se somministrato a donatori sani o nei pazienti in associazione a farmaci chemioterapici, il G-CSF stimola la migrazione delle cellule staminali emopoietiche dal midollo osseo verso il sangue periferico
Raccolta di cellule staminali emopoietiche mediante aferesi
L’aferesi è una procedura terapeutica che permette di prelevare, mediante l’impiego di macchine, definite separatori cellulari una o più componenti del sangue.
Questa procedura si basa sul concetto della separazione del sangue mediante centrifugazione.
Le cellule del sangue infatti esistono sotto forma di una sospensione di particelle immerse in una componente liquida (plasma). Le cellule del sangue differiscono notevolmente tra loro per grandezza e densità. Tale caratteristica determina la possibilità di sedimentazione delle cellule in un campo gravitazionale.
Il sangue intero, debitamente anti-coagulato, se sottoposto a forza centrifuga elevata, sedimenta in strati distinti a seconda delle densità delle varie componenti.
Il separatore cellulare è uno strumento che preleva il sangue da una vena periferica (generalmente vengono utilizzate le vene antecubitali dell’avambraccio), o da una via di un accesso vascolare centrale, lo immette in un circuito sterile, lo sottopone ad anticoagulazione e, mediante un processo di centrifugazione, lo separa nelle sue componenti.
Attraverso un sistema di pompe peristaltiche, regolato da un software, il separatore cellulare permette di prelevare la componente desiderata (plasma, piastrine, globuli bianchi, globuli rossi). Dopo aver prelevato e raccolto la componente desiderata il separatore reinfonde il sangue al paziente/donatore.
La durata media di una procedura di aferesi per raccolta di cellule staminali e di circa 4-5 ore e dipende principalmente dalla capacità degli accessi vascolari utilizzati di sostenere gli elevati flussi di prelievo dettati dal separatore cellulare.
Il principale obiettivo di un programma di mobilizzazione, prelievo e trapianto di cellule staminali emopoietiche da sangue periferico è l’ottenimento di una dose adeguata di cellule staminali eseguendo il minor numero possibile di procedure di aferesi.
Punto cruciale è il riconoscimento del “timing”, cioè del momento ideale per l’inizio del programma terapeutico di raccolta delle cellule staminali. Senza un’attenta valutazione del momento più idoneo ad iniziare la raccolta delle cellule staminali circolanti, si corre il rischio di dover eseguire un numero elevato di procedure di aferesi senza raggiungere una dose sufficiente di cellule progenitrici per effettuare un trapianto.
Come visto in precedenza, esistono vari protocolli di mobilizzazione delle cellule staminali. Generalmente, dopo alcuni giorni dall’inizio della terapia di mobilizzazione (periodo variabile a seconda del protocollo utilizzato) si assisterà ad un aumento della concentrazione delle cellule della serie bianca e delle staminali circolanti.
I parametri ematici da tenere sotto controllo durante il periodo di mobilizzazione sono: conta dei globuli bianchi, conta delle piastrine e percentuale delle cellule mononucleate. Oltre a questi parametri è di fondamentale importanza l’analisi citofluorimetrica per la determinazione della quota di cellule CD34+ nel sangue periferico. Numerosi studi hanno infatti confermato che la conta delle cellule CD34+ circolanti è il parametro migliore per l’ottimizzazione di un programma di raccolta di cellule staminali emopoietiche da sangue periferico.
Altro punto fondamentale di un programma di raccolta di cellule staminali è la definizione del “target” di raccolta e quindi della quota ottimale di cellule staminali emopoietiche da raccogliere al fine di poter eseguire un trapianto. Tale quota deve essere sufficiente a garantire la piena e duratura ricostituzione del sistema emopoietico in un midollo sottoposto a protocolli radio-chemioterapici aggressivi nel più breve tempo possibile.
Rischi della procedura
I rischi della procedura sono principalmente legati a: volume di circolazione extracorporea, uso di anticoagulante, accessi vascolari.
L’aferesi prevede una quota di circolazione extracorporea pari al volume di sangue che durante la procedura riempirà il circuito del separatore cellulare. I separatori cellulari di nuova generazione prevedono quote di circolazione extracorporea di circa 200-300 ml. Considerato che il volume totale di sangue di un individuo adulto è di circa 5-6 litri, la problematica della circolazione extracorporea riguarda maggiormente i pazienti pediatrici. Durante l’esecuzione di un’aferesi si utilizza un anticoagulante, il citrato, che agisce chelando gli ioni calcio. Se il citrato viene somministrato ad alte velocità di flusso può ridurre notevolmente la concentrazione di ioni calcio, determinando nel paziente/donatore un’ipocalcemia iatrogena. Generalmente i sintomi da ipocalcemia durante una procedura di aferesi sono lievi e facilmente trattabili con la somministrazione di calcio gluconato endovena.
Altri problemi della procedura sono legati alla difficoltà di reperire accessi vascolari idonei per le velocità di flusso da sostenere. In questi casi è possibile dover ricorrere ad accessi vascolari centrali (cateteri venosi centrali generalmente inseriti in vena femorale) che possono esporre il paziente al rischio di trombosi ed infezioni.
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La Manipolazione Cellulare

La manipolazione cellulare è l’insieme delle procedure, più o meno complesse, che permettono alle cellule staminali emopoietiche di essere utilizzate ai fini trapiantologici. Nell’ambito della manipolazione cellulare, possiamo distinguere due grandi categorie: la manipolazione cellulare “minima” e quella “estensiva”. Questi termini servono a distinguere gli effetti che la manipolazione determina sulle cellule; in particolare, le definizioni date dal Comitato Nazionale per la Biosicurezza e le Biotecnologie, nel testo relativo alle Linee guida per la terapia cellulare sono le seguenti:
«Nella manipolazione estensiva di cellule e tessuti si includono tutte quelle manipolazioni che possono portare ad una attivazione delle cellule e/o ad una stimolazione della proliferazione cellulare.
Vengono considerate “estensivamente manipolate” anche le cellule che, pur non essendo state specificamente attivate o stimolate a proliferare, risultano associate con biomateriali, sia che si tratti di biomateriali sintetici, sia che si tratti di biomateriali di origine estrattiva, così come quelle che hanno subito una manipolazione del loro patrimonio genetico.
Per manipolazione minima si intende quella tipologia di manipolazione che non porta ad una attivazione delle cellule e/o ad una stimolazione della proliferazione cellulare. In particolare, sono considerate “manipolazione minima”: il taglio, la modificazione della forma, la criopreservazione, la sterilizzazione mediante radiazioni gamma, la centrifugazione ed il trattamento con antibiotici di un tessuto. Analogamente sono considerate “manipolazioni minime” l’estrazione o la separazione di cellule da un tessuto, quando questo non alteri le caratteristiche principali delle cellule e del tessuto rimanente dal quale le cellule sono state estratte o separate».
Relativamente al nostro scopo, possiamo includere nella manipolazione cellulare minima le seguenti attività:
  • filtrazione
  • eritrodeplezione
  • deplasmazione
  • selezione cellulare
  • criopreservazione
I concentrati cellulari potranno essere sottoposti a tutte o solo ad alcune di esse, in funzione dell’uso clinico al quale si dovranno avviare le cellule trattate.
Di seguito saranno messi in evidenza gli argomenti relativi ai luoghi nei quali è possibile effettuare la manipolazione (il laboratorio di manipolazione cellulare) e alle manipolazioni specifiche alle quali è necessario sottoporre un concentrato.
Il laboratorio di manipolazione cellulare e criopreservazione
Il laboratorio di criopreservazione è l’unità intermedia per l’esecuzione di un trapianto autologo o allogenico di cellule staminali emopoietiche, qualunque sia la loro origine.
Nel nostro caso, è la struttura che riceve l’unità di cellule staminali e che è deputata alla sua manipolazione, criopreservazione e stoccaggio secondo criteri previsti dalle norme vigenti ed in accordo con gli standard internazionali.
Le norme attuali prevedono che i centri di manipolazione cellulare e criopreservazione siano dotati di almeno un locale adibito esclusivamente alla manipolazione cellulare; altresì, oltre al locale per la manipolazione, è necessaria la presenza di uno spazio dove saranno collocati i contenitori criogenici ad azoto liquido per lo stoccaggio delle unità criopreservate e i congelatori a –20 o –40 °C per la conservazione dei campioni di siero.
Tutti i contenitori devono prevedere un sistema di controllo e registrazione della temperatura (anche manuale) ed un sistema di rifornimento dell’azoto liquido. Gli ambienti devono rispettare i principi di buona conduzione dei luoghi di lavoro ed in particolare devono essere:
- ben curati igienicamente e facilmente lavabili;
- esenti da rischi di contaminazione chimica, fisica e biologica.
Manipolazione cellulare
Come detto nell’introduzione, la manipolazione cellulare che viene effettuata a carico delle unità di cellule staminali emopoietiche può rientrare in una delle seguenti procedure: filtrazione, eritrodeplezione, deplasmazione, immunoselezione, criopreservazione. A questo elenco va aggiunto lo scongelamento delle unità criopreservate, procedura fondamentale soprattutto nell’esecuzione dei trapianti con cellule staminali provenienti da sangue placentare.
Filtrazione
La filtrazione è una delle procedure più semplici nell’ambito della manipolazione cellulare minima, benché, in alcuni casi, sia di enorme importanza per la buona riuscita delle procedure successive, qualora queste siano necessarie. Così come le altre procedure, in alcuni casi, può essere l’unica alla quale un’unità può essere sottoposta prima del trapianto.
La fonte di cellule che necessità sempre della filtrazione è il midollo osseo, in quanto per le caratteristiche stesse del prelievo, nell’unità sono presenti una grande quantità di detriti, soprattutto ossei, che determinerebbero una serie di problematiche non facilmente sormontabili, qualora non venissero eliminati.
Dal punto di vista tecnico la procedura è particolarmente semplice, benché sia necessario che venga effettuata in ambienti idonei alla manipolazione cellulare. L’unità di cellule staminali viene fatta passare attraverso un filtro per l’infusione di emocomponenti, il quale ha la capacità di trattenere le particelle di grandi dimensioni, facendo passare, senza che vi siano danni, le altre componenti.
Eritrodeplezione
L’eritrodeplezione è una procedura necessaria per la riduzione della quantità di globuli rossi presenti nel concentrato cellulare. Rispetto alla filtrazione, l’allontanamento dei globuli rossi è un procedimento più complesso che può essere eseguito in vari modi e per numerosi motivi, sia in caso di trapianto autologo che allogenico.
Nel caso di cellule destinate all’uso autologo il motivo principale per il quale l’unità deve essere sottoposta ad eritrodeplezione è legato alla necessità di dover a congelare le cellule. Anche in questo caso, l’origine delle unità che devono essere sottoposte a questo trattamento è rappresentata dal midollo osseo.
Quando le cellule devono essere utilizzate per un trapianto allogenico, la deplezione dei globuli rossi è necessaria qualora ci fosse un’incompatibilità “maggiore” fra il donatore ed il ricevente nell’ambito del gruppo sanguigno AB0.
L’incompatibilità è detta “maggiore” quando sono presenti nel ricevente anticorpi rivolti verso gli antigeni presenti sui globuli rossi del donatore (ad esempio ricevente di gruppo 0 e donatore A).
Deplasmazione
La deplasmazione è una procedura necessaria sia nei concentrati derivanti dal sangue periferico che midollare o placentare.
In relazione all’uso allogenico o autologo, lo scopo della deplasmazione è differente. Nel caso di trapianto allogenico, la deplasmazione è necessaria in caso di incompatibilità “minore” o “mista”. Un esempio del primo caso può essere rappresentato da una situazione nella quale il donatore è, ad esempio di gruppo 0 ed il donatore di gruppo A o B, mentre nel caso dell’incompatibilità mista il gruppo del donatore ad esempio è A e quello del ricevente B.
Nel caso di trapianto autologo, lo scopo dell’allontanamento del plasma è quello di provvedere alla riduzione di volume dell’unità, facendo in modo che venga utilizzata la minor quantità possibile di soluzione di criopreservazione, per i motivi che vedremo in seguito, sia per ridurre lo spazio di stoccaggio.
Selezione cellulare
La selezione cellulare comprende una serie di procedure, particolarmente complesse, che portano alla selezione di elementi cellulari utilizzando, in genere, principi fisici.
Lo scopo della selezione è differente, in relazione all’uso che è necessario fare del concentrato cellulare; in caso di trapianto autologo, la selezione cellulare è necessaria in alcuni tipi di malattie oncologiche ed ematologiche al fine di purificare i concentrati cellulari da contaminazione neoplastica. Quando le cellule dovranno essere, invece, utilizzate in alcuni tipi di trapianti allogenici (soprattutto nei trapianti aploidentici) lo scopo della selezione è quello di allontanare le cellule chiamate in causa nella GvHD.
Criopreservazione
La criopreservazione consiste nell’insieme di tecniche necessarie ad avviare alla conservazione, per periodi anche lunghissimi, le cellule trattate. Questa procedura è conseguente ad alcune, e in alcuni casi a tutte, le metodiche descritte nei precedenti paragrafi.
Dal punto di vista tecnico, la criopreservazione rappresenta un momento critico della manipolazione cellulare; infatti in questa fase più che in altre, la vitalità cellulare può essere inficiata in maniera significativa.
La prima necessità di questo ramo delle criobiologia è quella di reperire la giusta velocità di congelamento delle cellule, senza che il passaggio dallo stato liquido a quello solido possa determinare danni.
Per ovviare a questi “effetti collaterali” si usano delle sostanze crioprotettive. Nel nostro caso viene utilizzata una particolare sostanza, il dimetilsulfossido (DMSO). Questa sostanza, a fronte di tale capacità protettiva, è anche estremamente dannosa per le cellule a temperatura ambiente, tanto che la soluzione di criopreservazione, costituita per il 20% dal dimetilsulfossido e per l’80% da albumina umana al 5% (o da plasma autologo), deve essere utilizzata e miscelata con il concentrato cellulare (in rapporto di 1:1) a bassa temperatura (5-6 °C).
Scongelamento
Lo scongelamento delle unità può essere effettuato al letto del paziente, somministrando l’unità in toto, compresa la soluzione di criopreservazione, oppure può essere eseguito eliminando il dimetilsulfossido che, ricordando ciò che è stato scritto in precedenza, a temperatura ambiente è tossico per le cellule.
Aspetti normativi
Fino alla fine degli anni ’90, la trapiantologia di cellule staminali non è stata regolamentata da particolari aspetti normativi, lasciando la possibilità di effettuare la raccolta, la manipolazione e l’esecuzione del trapianto secondo i criteri propri di ogni centro.

Nel 2003 sono state emanate le “Linee Guida Nazionali” deputate alla standardizzazione della trapiantologia, con particolare riguardo alla manipolazione cellulare. queste linee guida sono state seguite dal recepimento di direttive provenienti dalla Comunità Europea che fanno riferimento alla “Guida Europea delle Norme di Buona Fabbricazione”. In particolare, sono state recepite le direttive 2004/23/CE, 2006/17/CE e 2006/86/CE; queste prevedono criteri omogenei relativamente alla donazione e la manipolazione di cellule e tessuti, indipendentemente da quella che sia lo loro fonte. Inoltre, evidenziano i percorsi necessari per l’ottenimento degli accreditamenti descritti in precedenza.

Oltre alle normative legali, enorme ausilio alla diffusione degli accreditamenti volontari, con conseguente aumento della standardizzazione e della qualità delle procedure di manipolazione cellulare, è dato dalle pubblicazioni di manuali provenienti dalle società scientifiche impegnate in tale campo. In particolare, le principali linee guida provengono dalla pubblicazione degli “Standards Internazionali per la raccolta, la manipolazione e l’utilizzo dei prodotti per la terapia cellulare” giunti alla terza edizione ed emanati dalla Foundation for Accreditation Cell Therapy(FACT) in associazione con la Joint Accreditation Committee ISCT-EBMT (JACIE).

Al fine di omogeneizzare queste regolamentazioni con le linee guida provenienti dalla società scientifiche, è stato individuato nel Centro Nazionale Trapianti l’organo nazionale preposto alla raccolta ed al controllo dei decreti, delle leggi e delle linee guida nell’ambito della manipolazione cellulare, curandosi anche della vigilanza sull’applicazione di tali aspetti normativi.

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I Trapianti

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche è oggi largamente impiegato nel trattamento di molte patologie ematologiche, sia neoplastiche che non neoplastiche, e rappresenta una valida opzione terapeutica anche per le patologie dismetaboliche congenite e i gravi deficit immunitari.
Negli ultimi anni tale procedura è stata estesa, con successo, anche a pazienti affetti da tumori solidi e da patologie autoimmuni come, ad esempio, la sclerosi multipla.
Il mondo scientifico ha mostrato da sempre grande interesse per le cellule staminali ematopoietiche (CSE). Sono contenute nel midollo osseo, nel sangue periferico, nel sangue di cordone ombelicale ed in numerosi altri tessuti: infatti, oltre ai globuli bianchi, rossi e piastrine da esse derivano anche i macrofagi degli alveoli polmonari, le cellule del Kupffer nel fegato, gli osteoclasti, le cellule di Langherans nella cute, la microglia nel cervello e, come dimostrato recentemente, anche le cellule muscolari striate.
Le caratteristiche fondamentali delle CSE, che ne rendono possibile l’uso clinico nel trapianto, sono rappresentate da:
  • automantenimento (self-renewal)
  • differenziazione in precursori delle linee eritroide, mieloide, megacariocitica e linfoide
  • homing: termine con cui si intende la capacità delle CSE di raggiungere la sede midollare, dopo essere state infuse per via endovenosa, e di insediarsi nel microambiente midollare
  • capacità di mantenere caratteristiche di vitalità dopo processi di manipolazione come la criopreservazione e lo scongelamento.
Il trapianto di CSE è una procedura terapeutica complessa che consiste nell’infusione di cellule emopoietiche sane in seguito ad una terapia pre-trapianto volta ad eliminare le cellule malate e non più funzionanti, chiamata terapia di “condizionamento”. Il condizionamento pre-trapianto consiste nella somministrazione di chemio/radioterapia (TBI) ad alte dosi associata o meno a cortisonici, farmaci antiangiogenetici o ad anticorpi monoclonali, secondo protocolli standardizzati.
Le alte dosi di farmaci antiblastici e/o la radioterapia possono determinare complicanze ed effetti collaterali sia diretti, cioè dovuti alla stessa somministrazione, che indiretti, secondari alla tossicità d’organo caratteristica di questi farmaci, anche a distanza di tempo.
Gli effetti indiretti del condizionamento si manifestano a carico del fegato, del tratto gastroenterico (mucosite), del polmone, della vescica e di altri parenchimi con quadri specifici quali la cistite emorragica e la malattia epatica veno-occlusiva (VOD) o gravi deficit respiratori o di polmonite idiopatica, fino ad arrivare, nei casi più gravi, ad una irreversibile compromissione multiorgano (MOF).
Al condizionamento segue la cosiddetta fase di aplasia in cui, oltre ad un calo della concentrazione di emoglobina e del numero di piastrine circolanti, si assiste ad una drastica riduzione delle difese immunitarie del paziente, che lo espone ad un elevato rischio di infezioni e di emorragie anche fatali. Frequenti sono i casi di batteriemie, fungemie e sepsi silenti oppure di quadri infettivi conclamati, la maggior parte dei quali dovuti a germi opportunisti.
Alla fase di aplasia, di durata variabile, segue la fase di “attecchimento”, che consiste nella ripresa della funzione midollare: si definisce attecchimento in polimorfonucleati e/o in piastrine il raggiungimento di valori di granulociti neutrofili superiori a 500/mm3, e/o di piastrine superiori a 20.000-50.000/UL, per almeno tre giorni consecutivi.
Il trapianto di CSE si distingue in:
  1. Allogenico: trapianto in cui il donatore è rappresentato da una persona diversa dal paziente.
  2. Autologo: trapianto in cui il donatore è il paziente stesso.
Trapianto Allogenico
Le basi biologiche del trapianto allogenico sono state poste negli anni ‘50 con l’individuazione delle CSE nel sangue midollare e della scoperta del sistema maggiore di istocompatibilità nell’uomo (MHC-HLA). I primi tentativi pionieristici di trapianto sono stati effettuati tra gli anni ’50 e ’60 ed il primo trapianto, effettuato con successo, è stato pubblicato nel novembre del 1968. Nel 1975 il gruppo di Seattle ha pubblicato i risultati dei primi 110 pazienti trapiantati fornendo le basi per l’applicazione clinica del trapianto di midollo osseo su larga scala.
Attualmente, esistono diversi tipi di trapianto allogenico in base al tipo di donatore, alla fonte di CSE e al regime di condizionamento utilizzato.
2.1 Cenni sul sistema HLA
Alla base della bio-immunologia del trapianto allogenico di CSE vi è il sistema maggiore di istocompatibilità, attorno a cui ruota il complesso binomio donatore/ricevente. Il sistema maggiore di istocompatibilità (MHC) è un complesso di geni altamente polimorfico che gioca un ruolo critico nella risposta immunitaria sia cellulo-mediata che umorale. Esso comprende molecole di classe I e molecole di classe II che fungono da segnale per le cellule T circolanti nel riconoscimento di antigeni non self, cioè non appartenenti all’ospite. I cloni linfocitari che tendono a riconoscere antigeni self vengono eliminati durante la maturazione dei linfociti T mediante un processo di selezione cellulare, che distrugge o inibisce i linfociti T autoreattivi. Tale processo rappresenta il presupposto biologico della cosiddetta tolleranza immunologica. Il riconoscimento degli antigeni estranei, invece, avviene mediante l’interazione tra gli antigeni stessi, presentati all’interno di una vera e propria tasca dalle molecole dell’MHC, ed un recettore presente sui linfociti T (TCR) specifico per ciascun antigene.
Il sistema MHC, chiamato nell’uomo HLA (Human Leukocyte Antigen), è costituito da antigeni maggiori e minori di istocompatibilità.
Gli antigeni maggiori HLA di classe I (HLA-A, HLA-B, HLA-C) e di classe II (DR, DQ e DP) rappresentano le molecole con il più elevato grado di polimorfismo finora conosciute. Grazie a questa variabilità genetica, il sistema HLA è in grado di legare un’ampia selezione di antigeni potenzialmente patogeni e di innescare una valida risposta immunitaria cellulo-umorale.
Gli antigeni minori di istocompatibilità (miH) sono peptidi derivati da proteine intracellulari, presentati dalle molecole del sistema HLA alle cellule T.
Presupposto fondamentale perché donatore e ricevente siano istocompatibili è l’espressione tissutale in entrambi, di antigeni maggiori geneticamente identici. Nel trapianto allogenico di CSE, tale condizione insieme all’assenza nell’ospite di linfociti T immunocompetenti, permette al tessuto trapiantato di sopravvivere prevenendo, nella stragrande maggioranza dei casi, la reazione immunologica da parte del ricevente contro il donatore definita rigetto, e, in parte, quella montata dai linfociti T del donatore contro il ricevente, malattia del trapianto contro l’ospite: “graft versus host disease” (GvHD).
Per stabilire quali antigeni del complesso HLA siano presenti in ciascun individuo e per valutare il grado di compatibilità della coppia donatore-ricevente, si procede, prima del trapianto, alla tipizzazione HLA. Questa può essere eseguita mediante tecniche sierologiche o molecolari. Poiché la tipizzazione sierologica si rivela particolarmente imprecisa per gli alleli di classe II, che svolgono un ruolo predominante nell’insorgenza della GvHD, si ricorre a metodiche di tipizzazione che utilizzano la biologia molecolare. Il vantaggio correlato alla definizione molecolare degli antigeni maggiori di istocompatibilità, consiste nella migliore identificazione consentendo una più accurata analisi del sistema HLA nella coppia donatore-ricevente. La compatibilità per gli antigeni del sistema HLA in un trapianto allogenico di CSE, migliora l’attecchimento e riduce, senza tuttavia eliminarlo, il rischio di GvHD suggerendo l’esistenza di fattori concorrenti.
Nel contesto di un trapianto HLA-identico, l’alloreattività si esplica attraverso il riconoscimento degli antigeni minori di istocompatibilità del ricevente, trasportati dalle molecole HLA del ricevente stesso, ed identificati come estranei dal TCR dei linfociti T del donatore.
Tipologia di donatore allogenico di CSE
La condizione necessaria per eseguire un trapianto allogenico di CSE è rappresentata dalla disponibilità di un donatore HLA compatibile. L’estremo polimorfismo del sistema HLA nell’ambito della popolazione generale consente di reperire un donatore compatibile solo nel 30% dei casi in ambito familiare, definito “donatore correlato”. Tale percentuale aumenta relativamente al numero di fratelli di cui dispone il paziente, ed è ricavabile grazie alla seguente formula matematica: 1-(0.75)n°fratelli.
Il trapianto da donatore correlato viene definito singenico quando donatore e ricevente sono gemelli monocoriali e, pertanto risultano genotipicamente identici sia per gli antigeni maggiori che minori dell’HLA tanto che in questi casi la procedura trapiantologica non necessita di immuno-profilassi. Laddove il paziente non abbia un donatore correlato HLA-identico, oggi è possibile reperire un donatore non correlato compatibile o semicompatibile, o nell’ambito dei Registri Internazionali di Donatori Volontari di Midollo Osseo (Bone Marrow Donor Worldwide) o nell’ambito dei Network di Banche di Sangue di Cordone Ombelicale (SCO). Rivolgendosi ai Registri Internazionali di Donatori Volontari di Midollo Osseo, circa il 50% dei pazienti identifica un donatore compatibile in un tempo mediano di 4 - 6 mesi; probabilità che, tuttavia, si riduce in maniera drastica per i pazienti appartenenti ad etnie minori, dal momento che i donatori volontari iscritti ai Registri sono prevalentemente di razza caucasica. Rivolgendosi simultaneamente alle Banche di SCO, la probabilità di identificare un donatore aumenta fino a circa il 70%, grazie alle peculiarità biologiche di questa fonte di CSE che ne permettono l’utilizzo clinico anche nel caso di reperimento di unità di SCO semicompatibili con il paziente. Inoltre, le unità SCO risultano prontamente disponibili all’uso clinico consentendo di abbreviare i tempi che vanno dall’identificazione del donatore non correlato al trapianto da una mediana di 60 a 14 giorni.
Attualmente, i donatori volontari iscritti nell’ambito dei Registri Internazionali risultano essere oltre 10 milioni mentre le unità SCO disponibili in tutto il mondo sono oltre 300.000.
Oltre alla possibilità di utilizzare unità di SCO semi-compatibili con il paziente che non dispone di donatore compatibile né familiare né da Registro, l’alternativa terapeutica è rappresentata dall’uso del donatore familiare non compatibile o aploidentico. Dal momento che i geni del sistema HLA vengono trasmessi come una regione unica, definita “aplotipo” , per metà dal padre e per metà dalla madre, ogni paziente che dispone di un genitore o di un figlio è dotato di un potenziale donatore aploidentico nell’ambito familiare. Trattandosi di un trapianto incompatibile, tale procedura è quanto mai complessa e prevede l’uso di una pesante immunosoppressione che può essere eseguita o in vitro, attraverso tecniche di “deplezione dei linfociti T”, o in vivo attraverso l’uso di combinazioni di molteplici farmaci immunosoppressori. Tale strategia terapeutica è caratterizzata da un maggior rischio di complicanze trapianto correlate, soprattutto di natura infettiva, legate all’elevato potere immunosoppressivo insito nella procedura stessa ed è, pertanto, riservato a categorie di pazienti ad alto rischio in cui il trapianto è urgente e non dispongono di altre opzioni di trapianto allogenico. Il trapianto aploidentico rappresenta oggi un’alternativa terapeutica all’avanguardia nella cura di patologie ematologiche ad alto rischio e si associa a risultati clinici quanto mai promettenti legati alla possibilità di offrire l’opzione trapiantologica ad oltre il 95% dei pazienti, in tempi quanto mai brevi.
Fonti di CSE
Per circa 30 anni, l’unica sorgente di CSE per trapianto è stata rappresentata esclusivamente dal midollo osseo (MO); l’impiego clinico di CSE raccolte dal sangue venoso periferico (PB) e, successivamente dal sangue di cordone ombelicale (SCO) risale, infatti, a fine anni ’80, inizi anni ‘90. Precedenti studi in vitro avevano dimostrato la presenza di CSE sia nel PB che nel SCO, tuttavia, solo più tardivamente fu dimostrata la loro capacità di ricostituire l’ambiente midollare dopo trattamento chemio-radioterapico ad alte dosi.
La principale differenza tra le 3 fonti di CSE attualmente disponibili consiste nella modalità di raccolta, nella quantità e nella qualità delle cellule contenute nel trapianto stesso.
Le CSE contenute nel MO vengono prelevate in anestesia generale o spinale attraverso ago-aspirati multipli di MO dalle creste iliache posteriori (intervento di espianto). Le CSE sono oggi identificali, attraverso l’utilizzo di anticorpi monoclonali con tecniche citofluorimetriche, grazie all’espressione sulla loro superficie dell’antigene CD34+. La mediana di cellule CD34+ che viene prelevata con la procedura di espianto midollare, e in grado di garantire un attecchimento emopoietico duraturo, è pari a circa 2.5 x 106/kg di peso del ricevente. Il trapianto di MO è caratterizzato, inoltre, dal contenuto di una scarsa quantità di linfociti T pari come valore mediano a circa 2.2 x 107/kg del ricevente.
Le complicanze legate alla procedura di espianto di MO sono fondamentalmente rappresentate dal rischio anestesiologico. Complicanze minori sono le microfratture del bacino, dolore ed ematomi della parte interessata.
La dose cellulare contenuta nel PB dopo opportuna stimolazione (con fattori di crescita granulocitari nel donatore o con farmaci immunosoppressori nel paziente per il trapianto autologo), risulta essere molto superiore a quella presente nel MO sia in termini di cellule CD34+ che di linfociti T. Mediamente, la dose di cellule CD34+ che vengono raccolte dal donatore sano dopo mobilizzazione con G-CSF è circa 2-3 volte maggiore rispetto a quella prelevata con l’espianto di MO. A tale incremento in termini di CSE corrisponde la presenza di un quantitativo di linfociti T circa 10 volte maggiore rispetto al trapianto di MO. La quantità e la qualità delle cellule contenute nel trapianto sono fattori determinanti nel decorso clinico dello stesso. Infatti, se ad una maggiore dose cellulare di CSE corrisponde un più rapido attecchimento emopoietico, ad una maggiore dose di linfociti T corrisponde una maggiore incidenza di GVHD. La procedura di raccolta delle PBSC viene definita stamino-aferesi in quanto si avvale dell’utilizzo di una macchina, il separatore cellulare, che sfruttando la circolazione extra-corporea è in grado di separare le cellule mononucleate dalla restante parte corpuscolata del PB, quali i globuli rossi e le piastrine che vengono, quindi, restituiti al donatore. Le complicanze più frequenti legate alla raccolta delle PBSC sono dovute alla somministrazione del fattore di crescita granulocitario nei giorni precedenti alla aferesi (febbricola, mialgia, cefalea) o agli squilibri elettrolitici che si possono determinare durante la procedura stessa con l’insorgenza di parestesie.
Il SCO è caratterizzato da un contenuto di cellule staminali emopoietiche simile a quello del midollo osseo adulto, ma con una maggiore proporzione di cellule progenitrici fenotipicamente immature dotate di maggiore potenziale proliferativo. Il SCO inoltre, presenta numerose peculiarità immunologiche tra cui le principali sono rappresentate da: una quantità assoluta di linfociti T inferiore rispetto al sangue periferico adulto e più primitiva ed immatura, a cui funzionalmente corrisponde una ridotta capacità di reazione.
La ridotta reattività immunologica dei linfociti T del SCO si traduce dal punto di vista clinico in un minor rischio di GvHD e, di conseguenza, nella tolleranza di una parziale incompatibilità sul sistema HLA della coppia donatore/ricevente, per cui il pool dei potenziali donatori per un paziente risulta notevolmente amplificato. In compenso sono presenti linfociti Natural Killer (NK) con capacità di reazione citotossica diretta, che sono i probabili effettori di un effetto “graft versus tumor” conservato nel trapianto di SCO, deducibile da studi clinici sul trapianto da SCO che mostrano un rischio di recidiva paragonabile a quello ottenuto con il trapianto di CSE da donatore non correlato volontario.
Il SCO è facile da raccogliere e da criopreservare, senza alcun rischio per la madre e per il neonato; consente di implementare il pool di aplotipi rari attraverso la criopreservazione di campioni risultanti da connessioni interrazziali; una volta criopreservato è facilmente reperibile e prontamente disponibile per i pazienti che necessitano di un trapianto urgente perché già studiato in maniera completa sia dal punto di vista infettivologico che per il sistema HLA; il rischio infettivologico, in particolare per la trasmissione di virus latenti quali CMV o EBV, è ridotto.
Principale limite per l’utilizzo clinico del SCO consiste nella bassa dose di cellule nucleate totali e di CD34+ contenute nelle singole unità, dovute allo scarso volume delle stesse: ciò comporta una ripresa emopoietica più tardiva e un maggior rischio di gramancato attecchimento rispetto alle altre fonti di CSE. Tale caratteristica ha inizialmente limitato l’uso del trapianto SCO ai soli pazienti pediatrici; attualmente, tuttavia, i pazienti adulti rappresentano 1/3 della popolazione sottoposta a trapianto da unità SCO e negli ultimi anni la loro proporzione tende a superare quella dei pazienti pediatrici. Ad oggi, oltre 8000 trapianti da SCO da donatore non correlato sono stati eseguiti, di cui oltre 2000 negli adulti, la maggior parte dei quali affetti da patologie maligne ad alto rischio.
Regimi di condizionamento
La terapia di condizionamento pre-trapianto consiste nella somministrazione, nell’arco di un periodo di tempo variabile tra 2 e 9 giorni, di alte dosi di chemio-radioterapia prima delle infusione delle CSE al fine di raggiungere i seguenti obiettivi principali:
  • L’eradicazione della malattia di base sfruttando l’effetto mieloablativo di dosi sovra-massimali di chemio-radioterapia al fine di determinare la totale scomparsa del compartimento di cellule staminali totipotenti malate del paziente e di “creare spazio” alle cellule progenitrici del donatore sano consentendone la successiva ricostituzione emopoietica.. Questo determina il presupposto per ottenere un “chimerismo completo”. Il ricevente è, infatti, una chimera in cui si viene a determinare la sostituzione del proprio compartimento staminale con quello del donatore attraverso una fase di compresenza del patrimonio genetico di due individui differenti.
  • Il superamento, mediante l’uso di agenti chemioterapici con potente effetto immunosoppressore, di una doppia barriera immunologica: la prima rappresentata dalle cellule immunocompetenti dell’ospite, che potrebbero essere responsabili del rigetto, e la seconda costituita dalle cellule immunocompetenti attive del donatore (prevalentemente linfociti T), presenti nella sospensione di CSE infuse, responsabili della graft versus host disease (GvHD). Il rigetto è un’evenienza rara e si verifica soltanto nell’1% dei casi, grazie all’effetto dei regimi di condizionamento che, deprimendo pesantemente il sistema immunitario del ricevente, lo rendono idoneo ad accettare il trapianto.
Le innovative terapie di supporto attualmente disponibili hanno notevolmente ridotto negli anni la mortalità trapianto correlata a breve termine legata alla tossicità d’organo delle alte dosi di chemio-radioterapia mieloablativa. Tuttavia, vengono oggi considerati eleggibili per un trapianto allogenico con condizionamento “mieloablativo” i pazienti di età inferiore a 55 anni, in buone condizioni generali, con funzionalità cardiaca, renale e respiratoria conservata, che non presentino altre gravi patologie al momento del trapianto. A partire dal 1996, per poter estendere la procedura trapiantologica allogenica anche ai pazienti che non rispondevano a questi requisiti, ovvero, non in grado di tollerare regimi di condizionamento “mieloablativi”, è iniziata la sperimentazione clinica di regimi di condizionamento ad intensità ridotta (RIC), basati sull’impiego di agenti immunosoppressivi e mielotossici a dosi non mieloablative, con conseguente minore tossicità globale acuta. I RIC basano il loro potere terapeutico non tanto sull’azione citoriduttiva della chemio-radioterapia, quanto sull’effetto immunoterapeutico del trapianto stesso, quindi sull’effetto “graft versus tumor” (GVT).
Alla fine degli anni settanta, il gruppo di Seattle dimostrò clinicamente quest’effetto evidenziando come la probabilità di recidiva di leucemia, dopo trapianto allogenico, fosse maggiore in assenza di malattia del trapianto verso l’ospite (GvHD). Successivamente, un’ampio studio condotto da dall’International Bone Marrow Transplant Registry (IBMTR) confermò come la recidiva di leucemia acuta mieloide fosse più frequente nei pazienti che non avevano segni di GvHD, ancora di più in trapianti T depleti (TCD) o nei trapianti singenici. Infine, la dimostrazione diretta dell’effetto terapeutico dell’infusione di linfociti del donatore (donor lymphocytes infusion, DLI) nel reindurre la remissione in pazienti con recidiva post trapianto di leucemia mieloide cronica, ha permesso di attribuire al trapianto allogenico di CSE un ruolo definitivo di immunoterapia adottiva. La ricostituzione immunologica ed ematologica dopo trapianto allogenico preceduto da RIC risulta essere più breve e, pertanto, tale procedura trapiantologica risulta ormai eseguibile anche in pazienti di età avanzata, fino a 65-70 anni, e/o caratterizzati da performance status non ottimale.
Considerando che molte neoplasie ematologiche hanno un’incidenza crescente con l’età, risulta chiaro come il trapianto allogenico RIC abbia permesso un aumento significativo della numerosità dei pazienti che potenzialmente vengono a beneficiarne.
Il trapianto autologo
Nel trapianto autologo donatore e ricevente coincidono. La procedura consiste nell’infondere al paziente, dopo chemio/radioterapia sovramassimale, CSE precedentemente prelevate. L’obiettivo che si pone l’autotrapianto è quello di trattare una patologia maligna, sia essa del sangue o di un organo solido, permettendo al soggetto di sopravvivere alla somministrazione di una terapia mieloablativa che eradichi la patologia stessa.
Nelle patologie autoimmuni il trapianto autologo si propone di ripristinare la tolleranza immunologica attraverso la sostituzione di in sistema immunitario reattivo contro antigeni self e pertanto non più funzionante. In questi casi i regimi di condizionamento mirano soprattutto all’immunodepressione dei cloni autoreattivi piuttosto che alla mieloablazione.
Le CSE per questo tipo di procedura trapiantologica possono essere prelevate dal midollo osseo o dal sangue venoso periferico, secondo le modalità precedentemente descritte.
A differenza di quanto avviene nel donatore sano, la mobilizzazione delle PBSC del paziente può avvalersi dell’impiego di chemioterapici come la Ciclofosfamide, oltre che di fattori di crescita. Attualmente i fattori che possono essere utilizzati per mobilizzare le CSE nel sangue venoso periferico sono: il recombinant granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF 5-20 mg/kg), recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rhGM-CSF; 5-10 mg/kg), e il ligando di Flt3 (un modulatore positivo dello sviluppo linfo-ematopoietico usato al dosaggio di 50 mg/kg/die). L’impiego del rhG-CSF è considerato il gold standard rispetto all’associazione del rhGM-CSF/rhG-CSF e all’utilizzo del solo ligando di Flt3 (33-35). Gli effetti collaterali, legati alla mobilizzazione con G-CSF, sono di scarsa entità e sono generalmente rappresentati da una sindrome simil-influenzale caratterizzata da cefalea, dolori ossei e rialzo asintomatico di fosfatasi alcalina e gammaGT. Complicanza più grave è rappresentata dalla necessità di posizionare un catetere venoso centrale con i rischi trombotico-emorragici ad esso connessi.
Nel trapianto autologo, le CSE dopo la fase di raccolta vengono sottoposte a una procedura di criopreservazione che prevede l’uso di un agente criopreservante, il dimetilsulfossido, in grado di bloccare il ciclo cellulare delle cellule durante la fase di congelamento mantenendole vitali nella fase di scongelamento che precede l’infusione, cioè il trapianto. Per criopreservazione si intende una procedura con la quale, mediante una macchina a discesa programmata della temperatura, le CSE vengono lentamente portate a bassissime temperature (-197 °C) in modo da poter essere conservate in azoto liquido. Uno dei maggiori problemi legato alla raccolta delle CSE per trapianto autologo è rappresentato dall’impossibilità, in alcuni casi, di ottenere un numero adeguato di CSE sia dopo mobilizzazione che con l’espianto di MO. Il danno subito dal midollo emopoietico e del microambiente da parte della malattia di base o della precedente esposizione a chemio/radioterapia potrebbe, in parte, spiegare questo fenomeno. Altri fattori sono, tuttavia implicati nell’outcome della raccolta di CD34+ come l’età, il sesso ed il tipo di malattia.
Le neoplasie ematologiche, per cui il trapianto autologo rappresenta parte integrante del piano terapeutico, sono:
  • Patologie linfoproliferative croniche (Mieloma Multiplo, Linfoma di Hodgkin, Linfoma non Hodgkin e, in misura minore, Leucemia linfatica cronica)
  • Leucemie acute
  • Tumori solidi
  • Patologie autoimmuni (es. sclerosi multipla)
Requisito fondamentale per l’esecuzione di questo tipo di procedura trapiantologica è il prelievo di un numero sufficiente di cellule staminali in grado di garantire la ricostituzione emopoietica sia a breve che a lungo termine.
Il problema legato all’utilizzo dell’autotrapianto nelle malattie onco-ematologiche, è rappresentato dal rischio di utilizzare, per il trapianto stesso, CSE contaminate da cellule tumorali. Per ovviare a questa evenienza si utilizzavano, in passato, metodiche di purificazione in vitro, come biglie immuno-magnetiche in grado di selezionare le sole cellule CD34+. Oggi si utilizzano procedure in vivo che hanno lo scopo di eliminare la malattia minima residua (MMR) mediante la somministrazione di anticorpi monoclonali che bloccano selettivamente le cellule neoplastiche. In seguito a questa procedura, detta purging, è possibile effettuare la raccolta di CSE.
Cenni sulle complicanze correlate al trapianto di CSE
Complicanze precoci
Infezioni: per la condizione di neutropenia, peculiare sia del trapianto autologo che allogenico, e per la spiccata immunodepressione, che caratterizza soprattutto il decorso del trapianto allogenico di CSE, le complicanze infettive sono frequenti, specie quelle da agenti opportunistici (37). Si possono verificare infezioni fungine rappresentate prevalentemente da polmoniti e sinusiti da Aspergillus ssp, mentre le infezioni da Candida si sono drasticamente ridotte grazie alla efficacia della profilassi. Le infezioni batteriche da Gram positivi sono spesso correlate al catetere venoso centrale di cui i pazienti sono portatori, nella maggioranza dei casi le sepsi da Gram negativi sono a partenza dal lume intestinale dove la barriera delle mucose risulta danneggiata dalla chemioterapia del regime di condizionamento e permette il passaggio dei germi in circolo.
La polmonite interstiziale da Citomegalovirus è stata una complicanza infettiva gravissima, attualmente in significativa riduzione grazie alla terapia precoce, definita “pre-emptive”, con antivirali come ganciclovir e foscarnet (38). La terapia pre-emptive viene iniziata prima che si sviluppi l’infezione virale e si fonda sui segni di riattivazione virale come la comparsa dell’antigene capsidico virale nel sangue, la proteina pp65 (antigenemia), valutata mediante immunofluorescenza sui neutrofili oppure sulla ricerca del DNA virale in a base tecniche di biologia molecolare (39). Anche il virus respiratorio sinciziale, i virus influenzali e parainfluenzali e gli adenovirus possono provocare polmoniti interstiziali la cui mortalità risulta molto elevata, soprattutto dopo trapianto allogenico da donatore non correlato di CSE.
Cistite emorragica: la cistite emorragica è provocata o dall’effetto tossico diretto sulle cellule uroteliali del ciclo di condizionamento o da infezioni provocate da virus che interessano il tratto urinario. La prima condizione può manifestarsi sia dopo il trapianto autologo che allogenico di CSE mentre la cistite emorragica ad eziologia virale è una complicanza peculiare del trapianto allogenico, tanto più frequente quanto più è elevato la stato di immunodepressione del paziente. La cistite emorragica iatrogena appare precocemente ed i farmaci maggiormente implicati nella patogenesi sono rappresentati dalla ciclofosfamide e dall’ifosfamide. La forma associata ad infezioni virali compare più tardivamente, in genere dopo il giorno +30 dal trapianto ed appare dovuta a polioma virus e adenovirus
Malattia veno-occlusiva epatica: è una complicanza ad insorgenza precoce entro i primi 20 giorni post-trapianto e viene favorita da cicli di condizionamento a base di busulfano per os e ciclofosfamide. Il quadro clinico è caratterizzato da ittero a bilirubina diretta, dolore in sede ipogastrica destra per epatomegalia con occlusione ed inversione del flusso ematico a livello delle vene sovra-epatiche, e aumento ponderale dovuto a conseguente versamento ascitico.
Anemia microangiopatica: è un quadro clinico caratterizzata da rottura dei globuli rossi “emolisi” meccanica che provoca danni specie a livello cerebrale e renale.
Recidiva di malattia: l’incidenza di recidiva varia secondo il tipo di malattia, la fase in cui il trapianto è stato eseguito, l’insorgenza di GVHD nel trapianto allogenico e lo stato di immunodepressione. Si verifica nella maggioranza dei casi entro il primo anno post-trapianto, ma può presentarsi anche in fase più tardiva
Rigetto: a differenza del trapianto di organo solido, insorge raramente grazie all’uso di potenti immunosoppressori in grado di eliminare i linfociti T immunocompetenti dell’ospite.
Graft versus Host Disease acuta: è mediata dai linfociti T del donatore che aggrediscono i tessuti del ricevente ed è indotta da differenze HLA tra donatore e ricevente. E’ una complicanza unica e caratteristica del trapianto di CSE allogenico e l’incidenza è maggiore nei trapianti da donatore parzialmente compatibile o non correlato. La GVHD acuta si manifesta entro i primi 100 giorni dal trapianto, i principali organi bersaglio sono la cute il fegato e l’intestino. Il quadro clinico cutaneo varia da lieve eritema ad epidermolisi generalizzata. A livello epatico si manifesta con un quadro prevalentemente colestatico fino ad insufficienza epatica acuta. Il danno intestinale è caratterizzato da dolori addominali e diarrea acquosa spesso ad impronta emorragica. A seconda della gravità quadro clinico si distinguono 4 gradi di severità della GVHD acuta; la mortalità del IV grado, che si sviluppa in circa il 20% dei casi, è pari all’ 80%. La terapia di prima linea consiste nell’uso di alte dosi di steroidi, mentre nelle forme refrattarie la terapia di seconda linea è meno standardizzata.
Complicanze tardive
Graft versus host disease cronica: rappresenta una complicanza esclusiva del trapianto allogenico di CSE.
La sintomatologia della GVHD cronica è multiforme, caratterizzata da un processo infiammatorio ad impronta fibrotica che può interessare qualsiasi organo e che è simile a malattie autoimmuni; il coinvolgimento cutaneo si manifesta con quadri simili alla sclerodermia ed è tipica la “sicca sindrome” con secchezza ed atrofia delle congiuntive e delle mucose del cavo orale, a carico delle articolazione si sviluppa artropatia e fascite con importanti limitazioni della motilità, a livello polmonare si osserva fibrosi con bronchiolite obliterante, a livello epatico una epatopatia ad impronta colestatica.
Il sistema immunitario dei pazienti affetti da GVHD cronica risulta molto compromesso e possono svilupparsi gravi infezioni opportunistiche. La GVHD cronica rappresenta la più importate causa di mortalità e morbilità trapianto-correlata dopo i primi 100 giorni dal trapianto e nelle forme severe peggiora in modo importante la qualità della vita dei pazienti.
Endocrinopatie: circa il 10% dei pazienti sottoposti a trapianto di CSE manifesta ipotiroidismo, più frequentemente dopo condizionamento comprensivo di TBI.
Le ghiandole sessuali, ovaie e testicoli, possono venire danneggiate da TBI e busulfano, evolvendo in un quadro di ipogonadismo associato a sterilità.Nei pazienti pediatrici l’accrescimento è notevolmente alterato specialmente nei condizionamenti con associazione di chemioterapia più radioterapia ed è stata osservata una ridotta secrezione di ormone della crescita.
Seconde neoplasie: il rischio di sviluppare una neoplasia solida è aumentato dopo il trapianto di CSE, presentando una incidenza dell’ 8% a 20 anni e tale rischio aumenta con il follow up, senza mostrare evidenza di plateau. Il melanoma, i tumori squamosi del cavo orale, i tumori del fegato, del sistema nervoso centrale e della tiroide sono i più frequenti.
Disordini linfoproliferativi post-trapianto (post transplant lymphoproliferative disorders PTLD): sono sindromi linfoproliferative a linfociti B, associate a disfunzione dei linfociti T ed infezione da virus di Epstein-Barr. Clinicamente si manifestano con febbre, associata a adenomegalie con possibile interessamento anche di organi extralinfonodali, la maggiore incidenza si osserva nei trapianti allogenici non correlati, aploidentico e/o T-depleti; il periodo di insorgenza è dopo 1-5 mesi dal trapianto.
Indicazioni terapeutiche del trapianto di CSE
Classificazione delle indicazioni in base alle evidenze scientifiche
Le indicazioni al trapianto autologo e allogenico di CSE sono classificabili in base all’evidenza dei risultati ottenuti da studi possibilmente prospettici e randomizzati. Seguendo i risultati ad oggi disponibili, il gruppo Europeo per il Trapianto di Midollo Osseo (’EBMT) ha proposto la seguente classificazione(20):
  1. Trapianto come “standard of care” : le patologie in cui i risultati ottenuti sono validati, ben definiti e superiori rispetto a strategie terapeutiche non trapiantologiche
  2. Trapianto come “opzione clinica”: le patologie in cui i risultati sono nettamente influenzati da diverse variabili quali, ad esempio, la fase della malattia al momento del trapianto, il tipo di condizionamento e il tipo di donatore utilizzato nel trapianto allogenico. In tale categoria vengono inclusi anche i trapianti effettuati per malattie relativamente rare in cui, pertanto, l’esperienza clinica è limitata. I benefici ed i rischi di un trapianto in queste categoria devono essere valutati e discussi.
  3. Trapianto “sperimentale”: le patologie in cui l’indicazione al trapianto deve essere ancora validata e quindi, tale opzione terapeutica dovrebbe essere considerata solo nell’ambito di protocolli ben definiti da studi cooperativi o monocentrici.
  4. Trapianto “non raccomandato”: le patologie in fase precoce in cui i risultati delle opzioni terapeutiche convenzionali non-trapiantologiche sono soddisfacenti e non giustificano il rischio di mortalità trapianto correlata; o, viceversa, quelle malattie in fase troppo avanzata in cui è prevedibile un margine di successo minimo.
Principali indicazioni terapeutiche del trapianto di CSE
Leucemia Mieloide Acuta: attualmente i pazienti affetti da leucemia mieloide acuta vengono stratificati in diverse categorie di rischio in base alle caratteristiche cliniche, citogenetiche e molecolari presenti alla diagnosi. Per i pazienti a basso rischio in I remissione completa (RC) i risultati della chemioterapia associata o meno all’autotrapianto di CSE non sembrano inferiori al trapianto allogenico ed in particolare, nella leucemia promielocitica in I RC il trapianto allogenico non trova indicazione per gli eccellenti risultati ottenuti dalla associazione chemioterapia + acido trans-retinoico. Nei pazienti a rischio intermedio-alto, invece, l’opzione trapianto allogenico da donatore familiare HLA identico risulta la migliore possibilità di cura. In tutti i pazienti con fattori prognostici sfavorevoli oppure oltre la I RC, la possibilità di ottenere una lunga sopravvivenza con la sola chemioterapia è molto bassa; quindi, una strategia trapiantologica allogenica, anche da donatore non correlato, viene considerata lo “standard of care”.
Leucemia Linfoide Acuta: La maggior parte degli studi indicano come “standard care” il trapianto allogenico nei pazienti con fattori prognostici clinico-biologici sfavorevoli all’esordio, nel caso di marker molecolari positivi nonostante l’ottenimento di una remissione completa morfologica e in tutti i casi di malattia avanzata (cioè, oltre la I remissione completa). In questi casi, per i pazienti che non dispongono di un donatore familiare compatibile è indicata la ricerca del donatore non correlato.
Il ruolo dell’autotrapianto è marginale nel trattamento di questa patologia in quanto la maggior parte degli studi randomizzati hanno evidenziato risultati similari rispetto all’uso della chemioterapia da sola o, anche peggiori, se confrontato con il trapianto allogenico.
Mieloma Multiplo: Nell’ultimo decennio l’uso terapeutico di terapie innovative, quali i farmaci anti-angiogenetici e i proteosomi-inibitori, ha modificato le indicazioni trapiantologiche in questo tipo di patologia. Infatti, se prima il gold standard era rappresentato da polichemioterapia seguita da doppio autotrapianto, le esperienze attualmente disponibili indicano una complementarietà tra l’uso delle terapie innovative e il singolo auto-trapianto. Il secondo autotrapianto non trova più indicazione in quanto l’uso dei nuovi farmaci come terapia di mantenimento dopo il primo autotrapianto sembrano dare risultati similari al doppio autotrapianto
Il trapianto allogenico, invece, rappresenta una valida “opzione terapeutica” nei pazienti o ricaduti dopo trapianto autologo, o che non raggiungono la remissione completa con i presidi terapeutici attualmente disponibili. Infine, nei casi che presentano fattori biologici a valore prognostico sfavorevole alla diagnosi, la letteratura indica come valida “opzione terapeutica” il trapianto allogenico RIC dopo l’autotrapianto.
Leucemia Mieloide Cronica: l’indicazione al trapianto di CSE è oggi molto dibattuta, in quanto tale patologia rappresenta il prototipo di malattia in cui i progressi della terapia medica, intesi come la scoperta dei farmaci inibitori delle Tirosin-Kinasi, hanno drasticamente migliorato la prognosi di questi pazienti. Attualmente, il trapianto allogenico sia da donatore correlato che non correlato rappresenta è indicato nei soggetti giovani resistenti ai farmaci inibitori delle Tirosin-Kinasi.
Anche il trapianto autologo oggi non viene più praticato per la cura di questa patologia; tuttavia nei casi in cui viene raggiunta la remissione molecolare della malattia con gli inibitori delle Tirosin-Kinasi vi è l’indicazione alla raccolta delle CSE autologhe per eventuali strategie terapeutiche future.
Linfoma non Hodgkin aggressivi: L’ingresso degli anticorpi-monoclonali nella strategia terapeutica di questo tipo di patologie ne ha modificato l’indicazione trapiantologica. Infatti, attualmente gli studi prospettici randomizzati disponibili suggeriscono, ma non sono conclusivi, per la superiorità dell’autotrapianto dopo poli-chemioterpia associata agli anticorpi monoclonali. Il trapianto autologo rappresenta oggi la terapia standard nei pazienti ricaduti che con malattia sensibile alla chemioterapia. La maggior parte degli studi disponibili evidenziano, infine, l’indicazione al trapianto allogenico nei pazienti ricaduti, con malattia ancora chemiosensibile, dopo aver effettuato l’autotrapianto come chemioterapia di salvataggio. In questi casi, il RIC rappresenta una valida “opzione terapeutica“ .
Linfoma di Hodgkin: Il trapianto autologo viene oggi considerato “standard of care” per i pazienti recidivati dopo una prima linea di polichemioterapia. Il trapianto allogenico trova, invece, la sua indicazione come valida “opzione clinica” nei pazienti con malattia resistente ma ancora chemio-sensibile. I RIC mostrano una superiorità nei risultati in termini di sopravvivenza globale e sopravvivenza libera da malattia rispetto all’uso dei regimi di condizionamento mieloablativi e, pertanto, tale opzione clinica può essere utilizzata nei pazienti con malattia pluri-refrattaria chemio-radiosensibile, dopo aver sfruttato l’effetto debulking del trapianto autologo .
Aplasia Midollare Severa: Il trapianto allogenico trova la sua indicazione nei bambini o nei pazienti giovani con conta di neutrofili < 300/mm3, che dispongono del donatore correlato HLA identico. Nei casi di indisponibilità del donatore familiare, è indicato attivare una ricerca da donatore non correlato nei casi di non risposta alla terapia immunosoppressiva. In questi casi si preferiscono regimi di condizionamento altamente immunosoppressivi e il midollo osseo come fonte di CSE, per il minor rischio di GVHD cronica ad esso correlato.
Emoglobinopatie: Trattandosi di patologie congenite, il trapianto autologo non trova alcuna indicazione terapeutica. Il trapianto allo genico, invece, rappresenta l’unica opzione curativa di queste patologie, inducendo la scomparsa dei sintomi e del fabbisogno trasfusionale. Sono candidati al trapianto allo genico tutti i soggetti con alfa o beta talassemia in età pediatrica, con fabbisogno trasfusionale e donatore familiare HLA identico. Negli adulti e nei pazienti senza donatore familiare si pone l’indicazione al trapianto in casi selezionati.
Il trapianto allogenico ha indicazione anche nei pazienti affetti da anemia falciforme con complicanze cliniche ricorrenti, quali crisi toraciche ed ossee dolorose ricorrenti e/o danno ischemico cerebrale.
Errori Congeniti del Metabolismo: Sono malattie rare e con caratteristiche clinche molto differenti tra loro. Anche in questi casi il trapianto autologo non trova nessuna indicazione terapeutica, laddove il trapianto allogenico rappresenta l’unica possibilità di cura. La maggiore esperienza si ha con le mucopolisaccaridosi e l’ostepetrosi con buoni risultati se il trapianto viene effettuato in fase precoce.